## 产品及特点

本产品是基于探针法荧光定量PCR原理开发的检测试剂盒，具有以下显著特点：

1. **即开即用**：用户仅需提供样品DNA模板，便可开始实验。

2. **高灵敏度**：经过优化的引物和组分，提高了检测的敏感性。

3. **阳性对照提供**：配备阳性对照，有助于有效区分假阴性样品。

4. **高特异性**：引物设计基于中间普雷沃菌DNA序列的高度保守区，避免与其它生物样本DNA的交叉反应。

5. **定性与定量双重检测**：可用于定性检测，同时支持定量检测，线性范围可达至少5个数量级。

6. **充足的实验量**：本产品可支持50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

7. **科研用途**: 本产品仅限于科研使用。

## 使用方法

### 一、DNA提取（样本制备区）

采用适合的方法提取并纯化样品DNA，此试剂盒与多数市场核酸提取试剂盒兼容。

### 二、稀释标准曲线样品（样本制备区）

由于阳性对照的浓度较高，因此以下稀释步骤应在独立区域进行，以避免样品或其他试剂的污染：

1. 标记6个离心管，分别为7、6、5、4、3、2。

2. 在每管中加入45μL DEPC-H2O。

3. 在7号管中加入5μL阳性对照（1×10⁸拷贝/μL），充分震荡1分钟，生成1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品，放冰待用。

4. 依次继续将阳性对照稀释，直到得到6个不同稀释度的标准曲线样品，置于冰上待用。如无需制作标准曲线，直接将阳性对照稀释至1×10⁵拷贝/μL即可。

### 三、试剂配制（试剂准备区）

若有N个待检样品，准备N+2个qPCR管（N个待检样品 + 1个阴性对照 + 6个阳性对照），向各PCR管中分别加入相应成分，并转移至样本准备区。

### 四、添加模板（模板添加区）

向qPCR管中分别加入2μL模板，添加顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板和婴儿利什曼虫qPCR阳性对照，离心30秒后立即进行扩增反应。

### 五、扩增反应（扩增及产物分析区）

将PCR管放入PCR扩增仪器对应位置，按照扩增程序进行反应。

### 六、结果分析

1. 如果制作标准曲线，阳性对照浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线，再根据待测样品的Ct值推算样品的DNA浓度。

2. 如果未制作标准曲线，根据以下标准判定结果：

- 阳性对照：Ct值<30，有明显指数增长，呈现典型S型曲线。

- 阴性对照：Ct值≥38或无Ct值，无明显指数增长和平台期。

- 样本检测结果：Ct值<35，有明显指数增长，表示样本中检测出婴儿利什曼虫，结果为阳性；Ct值≥38或无Ct值，表示样本中未检测出婴儿利什曼虫，结果为阴性；Ct值在35-38范围应复检，如重复实验结果仍在该范围，可判定为阳性，否则为阴性。

## 运输及保存

本产品需低温运输，建议保存于-20℃，保存期为一年。阳性对照需单独存放，以防污染其他试剂。

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